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蛋白激酶將磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到蛋白多肽底物上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，直接影響目標(biāo)的活性和功能。放射性研究表明，真核細(xì)胞中大約30%的蛋白經(jīng)過磷酸化修飾。這一關(guān)鍵的翻譯后修飾調(diào)控了廣泛的細(xì)胞活性，包括細(xì)胞周期 、分化、代謝和神經(jīng)元通訊。此外，異常的磷酸化事件與許多疾病狀態(tài)相關(guān)。在評估磷酸化時，選擇的方法可能會有所不同，這取決于多個因素，包括提出的具體問題以及特殊儀器或試劑的可用性。如何檢測蛋白磷酸化，本文簡要介紹了幾種常用方法，并提出了每種方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
激酶活性分析
蛋白激酶通常是多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的常見組分，它們影響了眾多負(fù)責(zé)生物反應(yīng)的下游效應(yīng)物，因此，評估某個特定激酶的活性可能為平行通路 提供寶貴信息。生物學(xué)樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過一些報告系統(tǒng)來評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。此外，R&D Systems還提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能夠定量任何可產(chǎn)生ADP的激酶的活性。盡管我們能夠獲得有關(guān)特定激酶行為的信息，但評估細(xì)胞提取物中的酶活性僅僅揭開了信號通路的冰山一角。我們對蛋白如何被修飾還知之甚少，且體外活性分析也不能說明內(nèi)源磷酸酶活性的潛在作用。磷酸化蛋白的直接檢測可能為細(xì)胞如何應(yīng)對外界刺激提供更詳細(xì)的分析，因?yàn)榱姿峄亩蔚蔫b定為蛋白的表達(dá)和功能狀態(tài)提供信息。
磷酸化特異抗體的開發(fā)
直接測定蛋白磷酸化的一種經(jīng)典方法是將整個細(xì)胞與放射性標(biāo)記的32P-磷酸鹽共同孵育，獲得細(xì)胞提取物，通過SDS-PAGE分離，并曝光在膠片上。這種繁瑣的方法需要多次幾小時的孵育，且使用放射性同位素。其他傳統(tǒng)方法包括2D凝膠電泳 ，這種技術(shù)假定磷酸化會改變蛋白的遷移率和等電點(diǎn)。
鑒于這些方法很費(fèi)力，磷酸化依賴抗體的開發(fā)受到研究人員的極大歡迎。1981年，第一個有記錄的磷酸化抗體在兔子中產(chǎn)生，使用的是鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸結(jié)合物。這一抗體廣泛地識別了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后，利用合成的磷酸化肽段來免疫兔子，開發(fā)出多個磷酸化狀態(tài)特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標(biāo)蛋白磷酸化位點(diǎn)周圍的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產(chǎn)生高度特異的免疫試劑 。磷酸化特異抗體的出現(xiàn)為傳統(tǒng)方法的改進(jìn)以及新的免疫分析技術(shù)的開發(fā)打開了大門。在任何技術(shù)中使用磷酸化特異抗體的忠告是，成功的檢測依賴于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。
western blot
Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法，大部分細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都擁有開展這些實(shí)驗(yàn)的設(shè)備。利用SDS-PAGE分離生物樣品，隨后轉(zhuǎn)移到膜上(通常是PVDF或尼龍膜)，之后利用磷酸化特異的抗體來鑒定目的蛋白。典型的Western blot實(shí)驗(yàn)步驟避免了使用放射性同位素時的危險品和廢物處理要求。許多磷酸化特異抗體十分靈敏，可輕松檢測常規(guī)樣品(如10-30ug細(xì)胞提取物)中的磷酸化蛋白。由于測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，研究人員常常利用一個抗體來檢測同源蛋白的總水平(而不考慮磷酸化狀態(tài))，以確定磷酸化組分相對于總組分的比例，并充當(dāng)上樣內(nèi)對照?；瘜W(xué)發(fā)光和顯色法都很常用，而分子量marker常用來提供蛋白分子量的信息。
酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)
ELISA已逐漸成為測定蛋白磷酸化的一種有力方法。ELISA的定量能力優(yōu)于Western blot，且在調(diào)節(jié)激酶活性和功能的研究中表現(xiàn)出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態(tài)無關(guān)。隨后讓目的蛋白結(jié)合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復(fù)雜的異質(zhì)樣品(如細(xì)胞裂解液)中的一個組分。加入待分析的磷酸化位點(diǎn)特異的檢測抗體。這些分析通常設(shè)計為顯色或熒光檢測。產(chǎn)生的信號強(qiáng)度與最初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。與更為傳統(tǒng)的免疫印跡相比，磷酸化特異的ELISA技術(shù)具有一些優(yōu)點(diǎn)。首先，利用經(jīng)過校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)品，可輕松定量結(jié)果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特異的兩個抗體，帶來了高的特異性。第三，ELISA的靈敏度更高允許使用更少量樣品，檢測低豐度的蛋白。最后，微孔板形式的通量比傳統(tǒng)的Western blotting要高得多。ELISA通常帶來了激酶活性的間接測定。不過，另一類ELISA技術(shù)使用固定化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測方法，帶來激酶活性的更直接測定。
基于細(xì)胞的ELISA
盡管體外生物化學(xué)激酶分析(如典型的三明治ELISA)常用于假說檢驗(yàn)和藥物篩選，但它們無法復(fù)制細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境。分析完整細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化也許能更準(zhǔn)確地代表特定信號通路網(wǎng)絡(luò)的狀態(tài)。一些免疫分析最近被開發(fā)出來，能夠在完整細(xì)胞的背景下測定蛋白磷酸化。細(xì)胞在同一個孔中被刺激、固定和阻斷。使用磷酸化特異抗體，利用熒光或顯色檢測系統(tǒng)來評估磷酸化狀態(tài)。此外，在微孔板的同一個孔中同時檢測磷酸化蛋白和總蛋白。因此，來自目的蛋白的信號可通過第二種蛋白來標(biāo)準(zhǔn)化，校正各孔之間的差異，實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白水平的準(zhǔn)確評估，并比較多個樣品，與傳統(tǒng)免疫印跡中使用磷酸化特異和總蛋白抗體相似。這些分析繞過了制備細(xì)胞裂解液的需要，因此更適合高通量分析。
細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)和ICC/IHC
傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫組織化學(xué)(ICC/IHC)是檢測磷酸化事件的有力工具。流式細(xì)胞儀利用激光來激發(fā)用于抗體檢測的熒光染料。在評估同一個細(xì)胞中的多個蛋白時，必須精心選擇濾光片組合和熒光染料，其光譜不能重疊。流式細(xì)胞術(shù)很有優(yōu)勢，因其實(shí)現(xiàn)了快速、定量的單細(xì)胞分析。通過細(xì)胞表面標(biāo)志的分型可檢測異質(zhì)群體中特定細(xì)胞類型的蛋白，而無需在物理上分離細(xì)胞。通過這種方法可分析稀有的細(xì)胞群體，而不用擔(dān)心細(xì)胞損失或細(xì)胞分選過程中可能發(fā)生的蛋白表達(dá)變化。
ICC通常指的是利用顯微鏡對培養(yǎng)細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行檢測，而IHC指的是對完整組織切片中的蛋白進(jìn)行檢測。與流式細(xì)胞術(shù)相似，這些技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞或組織內(nèi)多個蛋白的評估，只是要足夠重視，避免熒光光譜或顏色的重疊。熒光和顯色檢測技術(shù)都經(jīng)常使用。與監(jiān)控磷酸化的其他形式不同，ICC通常是確定細(xì)胞內(nèi)定位的選方法。流式細(xì)胞術(shù)和ICC/IHC都需要高親和力、高特異性的抗體、阻斷步驟、對照和抗體滴定，以避免因非特異性結(jié)合而帶來的不明確結(jié)果。
通過流式細(xì)胞術(shù)和ICC來檢測磷酸化蛋白要求蛋白是穩(wěn)定的，且抗體能夠接近。細(xì)胞通常經(jīng)過刺激，并由甲醛或多聚甲醛固定，以交聯(lián)磷酸化蛋白，使其穩(wěn)定，便于分析。固定后的細(xì)胞必須經(jīng)過透化處理，讓磷酸化特異抗體可進(jìn)入細(xì)胞。對于不同的亞細(xì)胞定位，通常使用不同的透化技術(shù)。溫和的去垢劑可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)蛋白的檢測，而抗體要想接近核蛋白，可能需要使用酒精。酒精透化也可增強(qiáng)磷酸化特異抗體的磷酸化蛋白檢測，因酒精具有變性的特點(diǎn)。
質(zhì)譜
復(fù)雜的生物樣品(如細(xì)胞裂解液)中蛋白質(zhì)磷酸化的全面評估(磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué))對于了解基于磷酸化的信號網(wǎng)絡(luò)很重要。復(fù)雜的蛋白混合物中大規(guī)模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鑒定，以及磷酸化殘基的測序。質(zhì)譜(MS)技術(shù)是完成這些任務(wù)的有用工具。盡管質(zhì)譜在鑒定單個蛋白上具有出色的靈敏度和分辨率，但對于磷酸化蛋白的分析，還有一些固有的困難。首先，磷酸化肽段的信號通常較弱，因?yàn)樗鼈儙ж?fù)電荷，而電噴霧質(zhì)譜在正電模式下作用，因此電離效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很難觀察到低豐度目的蛋白的信號。為了克服這些缺點(diǎn)，人們已經(jīng)開發(fā)出一些富集策略，包括固定化金屬親和層析(IMAC)、磷酸化特異抗體富集、化學(xué)修飾法(如磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的β-消去反應(yīng))，以及用生物素化的基團(tuán)取代磷酸基團(tuán)。
多個分析物圖譜分析
質(zhì)譜技術(shù)如碰撞誘導(dǎo)解離(CID)和電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)，提供了肽段序列和翻譯后修飾(磷酸化)的全面平行分析。這些技術(shù)相當(dāng)費(fèi)力，而當(dāng)特定通路作為主要研究目標(biāo)時，可能不需要全面的磷酸化分析策略。這導(dǎo)致一些同時測定多個分析物的蛋白磷酸化的新方法被開發(fā)出來?？偟膩碚f，這些方法涉及到磷酸化特異抗體的使用，包括基于微孔板、磁珠和膜，基于磁珠和基于膜的檢測形式。這些分析明顯的好處在于通量能力被大大提高，避免了運(yùn)行多個Western blot或傳統(tǒng)的ELISA分析的需要。這些技術(shù)也能夠提供更多的數(shù)據(jù)，而所需的樣品量極少。相應(yīng)地，蛋白圖譜分析通常被認(rèn)為靈敏度不及傳統(tǒng)的對應(yīng)技術(shù)，因潛在的抗體交叉反應(yīng)性。
